آزمایش Cell Free DNA

تست غيرتهاجمي تشخيص سندرم داون

 تريزومي هاي 18 , 13 و تعيين جنسيت

 بر اساس اندازه گيري cell free DNA

Non Invasive Fetal Trisomy (NIFTY)

در سال 1997 دانشمندان به وجود DNA جنين در خون مــادر پي بردند. اين کشف مهم که با رديابي قسمت‌هايي از کروموزم Y جنيني در سرم مادر توسط Dennis Lo صورت گرفت، اساسي شد براي ظهور روش‌هاي غير تهاجمي تشخيص آنوپلوئيدي‌ها در دوران بارداري. اصول اين روش بر پايه اندازه گيري DNA آزاد در پلاسما است که از سلول هاي جفت آزاد مي شوند.

صاحب نظران، اين کشف را يک انقلاب ناميدند و پيش بيني مي کنند که در آينده نزديک تست هاي مبتني بر آن، جايگزين روش هاي سنتي غربالگري و آزمايش هاي تشخيصي دوران بارداري گردد.

روش مولکولي غيرتهاجمي براي تشخيص تريزومي‌هاي   21، 18 و 13

به طور کلي تمرکز برنامه هاي غربالگري دوران بارداري بر روي تشخيص سندرم داون، NTDs و دو آنوپلوئيدي اتوزومال ديگر که کمتر شايع هستند يعني تريزومي 18 (سندرم ادوارد) و تريزومي 13 (سندرم Patau) است. سندرم داون شايعترين آنوپلوئيدي در انسان با شيوع تقريباً 1 در 800 است. ريسک ابتلا جنين به سندرم داون با افزايش سن زياد مي شود بطوريکه يک خانم 45 ساله داراي ريسک 1 به 35 است. افراد مبتلا به سندرم داون توان ذهني پايين تر از حد ميانگين دارند و به طور معمول دچار ناتواني ذهني خفيف تا متوسط هستند. تعداد کمي از مبتلايان به سندرم داون دچار ناتواني شديد ذهني هستند. افراد مبتلا ممکن است دچار اين مشکلات شوند: ناراحتي هاي قلبي مادرزادي، ابتلا سريع به بيماريهاي عفوني، مشکلات تنفسي و برخي ناراحتي هاي گوارشي. بايد توجه داشت که پيشرفتهاي علم پزشکي درمان اکثر آنها را امکان پذير ساخته است، به گونه اي که افراد با سندرم داون تا سنين بالا (حدود 55 سالگي) مي توانند زندگي کنند. بر اساس آمار ثبت شده در امريکا انتظار مي رود که به ازاي هر يک ميليون بارداري حدود 1800 مورد سندرم داون، 300 مورد تريزومي 18 و 140 مورد تريزومي 13 بروز کند. تريزومي هاي 18 و 13 نيز مانند سندرم داون در سه ماهه اول و دوم شايع تر از موقع زايمان بوده و به ميزان زيادي سقط خود بخودي در آنها اتفاق مي افتد. مبتلايان به تريزومي 18 و 13 داراي عمر کوتاه مدتي بوده و فقط 5 تا 10 درصد آنها تا يک سالگي زنده مي مانند. در طي دو دهه اخير روش هاي مختلفي شامل اندازه گيري مارکرهاي شيميايي و پارامترهاي سونوگرافي و همچنين ترکيب اين دو با هم براي غربالگري سندرم داون ابداع شده است، اما به علت اشکالات موجود در اين روش ها، دانشمندان هميشه به دنبال يافتن روش هايي بهتر بودند.

بزرگترين ايراد در روش هاي سنتي غربالگري، درصد بالاي نتايج مثبت و منفي کاذب و در تست تأئيدي احتمال سقط جنين به علت تهاجمي بودن روش نمونه گيري است. از ديگر نکات منفي روش هاي غربالگري رايج ميتوان به چند مرحله اي بودن پروسه آزمايش، نتايج غير اختصاصي و گاهي گيج کننده و غير قابل تصميم گيري و در نتيجه افزايش ريسک استفاده از روش هاي تهاجمي اشاره کرد. در سال 1997 دانشمندان به وجود DNA جنين در خون مادر پي بردند. اين کشف مهم که با رديابي قسمت‌هايي از کروموزم Y جنيني در سرم مادر توسط Dennis Lo صورت گرفت اساسي شد براي ظهور روش‌هاي غيرتهاجمي تشخيص آنوپلوئيدي‌ها در دوران بارداري. اصول اين روش بر پايه اندازه گيري DNA آزاد در پلاسما است که از سلول هاي مرده جفت آزاد مي شوند. صاحب نظران اين کشف را يک انقلاب در علوم تشخيصي مي دانند و پيش بيني مي کنند که در آينده نزديک جايگزين تست هاي رايج غربالگري و تشخيصي دوران بارداري گردد.

بالاخره موفقيت واقعي در سال 2008 حاصل شد زمانيکه دو گروه مستقل از محققين با مطالعه بر روي دو جمعيت 18 و 14 تايي از جنين‌‌هاي مبتلا به آنوپلوئيدي، قدرت تشخيص تريزومي‌هاي جنين را با استفاده از تکنيک Sequencing Parallel Massively با درستي 100 درصد به اثبات رساندند. مطالعات پر جمعيت‌تري اخيراً گزارش شده است که ميزان تشخيص (Detection rate) اين روش را براي تريزومي 21 به ميزان 99.9% و با ويژگي 9/97 تا7/99 درصد نشان مي‌دهد. NIFTY روش جديد و غير تهاجمي غربالگري و با استفاده از تکنولوژي تعيين توالي  ، DNA آزاد جنين در خون مادر را که از هفته دهم بارداري به ميزان کافي افزايش مي يابد، بررسي مي کند. نيمه عمر اين DNA بسيار کوتاه بوده و کمتر از 2 ساعت مي باشد و بلافاصله بعد از تولد از خون مادر محو مي گردد بنابر اين بارداري هاي قبلي اختلالي در نتيجه تست ندارد. در اين روش بدون نياز به سلول هاي بافت جفت (CVS) يا نمونه گيري از مايع آمنيوتيک (آمنيوسنتز)، از چند ميلي ليتر خون وريدي مادر استفاده مي شود. در اين روش علاوه براينکه در يک تست همزمان تريزومي هاي 21، 18 و 13 به ترتيب با حساسيت 9/99 درصد بررسي مي شوند، درصد موارد مثبت و منفي کاذب نيز به ميزان کمتر از 1/0 درصد کاهش مي يابد. بايد توجه داشت که انجام اين تست، نياز به آزمايش AFP را براي بررسي   NTDs در سه ماهه دوم از بين نبرده و خانم باردار بايد حتماً در هفته هاي 15 تا 20 بارداري مجدداً به آزمايشگاه مراجعه کند.

به منظور آشنايي بيشتر با ارقام مورد بحث اگر فرض کنيم که کل موارد بارداري در ايران سالانه يک ميليون نفر باشد در صورت انجام آزمايش با روش جديد NIFTY، منافع ذيل قابل دستيابي است:

 1 - در روش سنتي تعداد بيماراني که با نتيجه مثبت کاذب جهت انجام آزمايش تأئيدي آمينوسنتز معرفي مي شوند تقريباً 50000 بيمار است اما با روش NIFTY تنها 340 نفر خواهند بود. بدين معني که سالانه بيش از 49600 مورد انجام روش آمنيوسنتز کمتر درخواست مي شود.

2 - تعداد موارد سقط جنين به دليل ارجاع جهت نمونه گيري تهاجمي در روش اول تقريباً 400 و در روش جديد فقط   3 مورد مي باشد.

3 - موارد منفي کاذب در روش غربالگري سنتي تقريباً 200 مورد است اما در روش جديد کمتر از 1 مورد خواهد بود يعني 199 بيمار کمتر در يکسال.

مزاياي تست :

       غيرتهاجمي بودن، براي انجام آزمايش فقط به 10 ميلي ليتر   از خون مادر احتياج است .  حساسيت و صحت بالاي تست، مطالعات بر روي جمعيت هاي  بيشتر از 1000 نفر ويژگي و حساسيت 99.9 %  را نشان داده است. تشخيص زودهنگام، آزمايش از هفته 10 بارداري قابل انجام بوده و اين زمان به تصميم گيري بهتر کمک مي کند.

موارد کاربرد :

      به عنوان يک تست غربالگري با قدرت تشخيص بسيار بالا يک انتخاب به عنوان يک تست تأييدي براي زناني که قادر به پذيرش خطر روش هاي تهاجمي نيستند. يک انتخاب براي مواردي که کشت سلولي با شکست مواجه مي شود.

در روش تهاجمي علاوه بر احتمال سقط جنين (2-4/0%) ، فشار روحي قابل توجه به مادر، دردناک بودن روش نمونه گيري و ريسک عفونت هاي داخل رحمي نيز قابل ذکر مي باشند. اصولا انتخاب بين تست هاي سنتي غربالگري که در آن احتمال خطا بالاست و آمينوسنتز يا CVS که احتمال سقط جنين را به همراه دارند براي زنان باردار کار دشواري است. همچنين از نظر زماني نيز انجام روش‌هاي غربالگري که در سه ماهه دوم بارداري امکان پذير مي باشد محدوديت هاي زماني را نيز براي تصميم گيري در مورد سقط قانوني يا نگهداشتن جنين به همراه دارد. علاوه بر آن در بسياري از موارد در صورت مثبت يا مشکوک بودن تست غربالگري در 3 ماهه اول، بيمار مجبور به انجام تست تاييدي در 3 ماهه دوم خواهد بود و در طول اين مدت تا انجام و دريافت نتيجه آزمايش دچار استرس و نگراني مي شود.

پيشنهادات :

1 -  انجام روش جديد مولکولي براي غربالگري آنوپلوئيدي ها.

 2  - کاربرد اين تست براي کساني که از نحوه نمونه گيري روش هاي تهاجمي وحشت دارند.  

3 -  انجام تست براي زناني که نمي توانند خطر سقط در روش هاي تهاجمي را بپذيرند

4  - انجام آزمايش AFP در سه ماهه دوم براي بررسي NTDs.

مقايسه روش‌هاي سنتي غربالگري سندرم داون با روش جديد مولکولي